Reactive Oxygen Species (ROS) Assay Kit

活性氧（ROS）檢測試劑盒

搜索關(guān)鍵詞：

Reactive Oxygen Species，ROS 活性氧；DCFH-DA；JC-1線粒體模電位探針；JC-10；CAS NO：4091-99-0；

研究意義：

活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）包括超氧自由基、過氧化氫、及其下游產(chǎn)物過氧化物和羥化物等，參與細(xì)胞生長增殖、發(fā)育分化、衰老和凋亡以及許多生理和病理過程。

產(chǎn)品描述：

活性氧檢測試劑盒（Reactive Oxygen Species Assay Kit，或ROS Assay Kit）是一種利用熒光染料DCFH-DA（2,7-Dichlorodihydrofluorescein diacetate）進行細(xì)胞內(nèi)活性氧水平檢測的常用方法。檢測原理在于DCFH-DA本身無熒光，能自由穿過細(xì)胞膜，一旦進入細(xì)胞后，被胞內(nèi)的酯酶水解生成無熒光的DCFH。DCFH不能穿透細(xì)胞膜，從而保留在胞內(nèi)。此時胞內(nèi)的活性氧可以氧化DCFH生成有熒光的DCF。通過DCF熒光的強弱即可反映活性氧的水平。
 

本試劑盒包含活性氧陽性對照Rosup，利于活性氧的檢測。Rosup是一種混合物，濃度為50mg/ml。

因檢測對象和反應(yīng)體系的不同，本試劑盒可檢測100-500個樣品。
 

產(chǎn)品組成：

保存與運輸方法：

保存：-20ºC保存，有效期一年。

運輸：冰袋運輸。

使用方法
1.   裝載探針

【注意】：對于刺激時間較短（通常2h以內(nèi)）的細(xì)胞，先裝載探針，后用活性氧陽性對照Rosup和/或待研究藥物刺激細(xì)胞；對于刺激時間較長（通常6h以上）的細(xì)胞，先用活性氧陽性對照Rosup或待研究藥物刺激細(xì)胞，后裝載探針。

1.1  原位裝載探針（僅適用于貼壁細(xì)胞）
a）檢測前一天進行細(xì)胞鋪板，確保活性氧檢測當(dāng)天細(xì)胞匯合率達(dá)到50~70%。
b） 吸出細(xì)胞培養(yǎng)液，加入適量體積以及濃度的待研究藥物，于37ºC細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育，具體誘導(dǎo)時間根據(jù)細(xì)胞類型和藥物自身特性決定。
【可選】陽性對照Rosup：先用無血清培養(yǎng)液按照1:1000比例稀釋陽性對照，通常 37℃培養(yǎng)箱內(nèi)刺激20~30min可以觀察到顯著的活性氧水平提高，但依細(xì)胞類型會有比較明顯差異【刺激時間可參考文獻或?qū)嶒灲?jīng)驗來調(diào)整】。如果刺激后30min內(nèi)未觀察到活性氧水平升高，可以適當(dāng)提高Rosup的工作濃度；反之，如果活性氧升高過快，則適當(dāng)降低Rosup的工作濃度。
c）按照1:1000用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA （10mM），使其終濃度為10μM.。吸出細(xì)胞培養(yǎng)液，加入適當(dāng)體積DCFH-DA工作液。
【注意】：加入體積以能充分蓋住細(xì)胞為宜。對于6孔板，每個孔加入DCFH-DA工作液不少于1ml。對于96孔板，每個孔加入DCFH-DA工作液不少于0.1ml。
d）37ºC細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20min。
e） 用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞三次，以充分去除未進入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。
 

1.2       收集細(xì)胞后裝載探針
1）按照常規(guī)方法，清洗并收集足量的細(xì)胞。【注意】：保證細(xì)胞的狀態(tài)健康。
2）用適量體積以及濃度的待研究藥物重新懸浮細(xì)胞，于37ºC細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育，具體誘導(dǎo)時間根據(jù)細(xì)胞類型和藥物自身特性決定。

【可選】陽性對照Rosup：先用無血清培養(yǎng)液按照1:1000比例稀釋陽性對照，通常 37℃培養(yǎng)箱內(nèi)刺激20~30min可以觀察到顯著的活性氧水平提高，但依細(xì)胞類型會有比較明顯差異【刺激時間可參考文獻或?qū)嶒灲?jīng)驗來調(diào)整】。如果刺激后30min內(nèi)未觀察到活性氧水平升高，可以適當(dāng)提高Rosup的工作濃度；反之，如果活性氧升高過快，則適當(dāng)降低Rosup的工作濃度。
3）  探針裝載前，按照1:1000用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA （10mM），使其終濃度為10μM.。
4）  離心，吸出細(xì)胞內(nèi)刺激藥物，之后用適量DCFH-DA工作液重懸細(xì)胞，使得細(xì)胞密度為1×10⁶~2×10⁷/ml。
【注意】：細(xì)胞密度需根據(jù)后續(xù)檢測體系，檢測方法，以及檢測總量來調(diào)整。例如，對于流式分析，單管檢測內(nèi)細(xì)胞數(shù)目控制在10⁴~ 10⁶之間。
5） 37ºC細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20min。每隔3~5min顛倒混勻一下，使探針和細(xì)胞充分接觸。
6）  用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞三次，以充分去除未進入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。

2.   檢測
2.1    原位裝載法
2.2    收集細(xì)胞后裝載法

 
3.   參數(shù)設(shè)置
4.   其他說明

注意事項

1） 探針裝載后，一定要洗凈殘余的未進入細(xì)胞內(nèi)的探針，否則會導(dǎo)致背景較高。

2） 探針裝載完畢并洗凈殘余探針后，可以進行激發(fā)波長的掃描和發(fā)射波長的掃描，以確認(rèn)探針的裝載情況是否良好。

3） 盡量縮短探針裝載后到測定所用的時間（刺激時間除外），以減少各種可能的誤差。

4） 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

 — —  Written/Edited by V. Shallan【版權(quán)歸MKBio懋康所有】

上海懋康生物科技有限公司是一家涉足于生命科學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域研究的試劑、儀器和實驗室消耗品與實驗服務(wù)工作，主要從事細(xì)胞生物學(xué)、植物學(xué)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)、生物化學(xué)、蛋白組學(xué)。生物制藥與診斷試劑研發(fā)生產(chǎn)等領(lǐng)域。 本公司秉承“以人為本，以誠為信、合同守信”的經(jīng)營理念。堅持"品質(zhì)保障"的原則為廣大客戶提供優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品。

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